Как секвенирование генома изменит хмель, ячмень и дрожжи

Издание Good Beer Hunting рассказывает о том, как секвенирование влияет на развитие основных пивных ингредиентов.

В начале XX века Эрнест Станли Салмон, профессор Уайского колледжа, расположенного неподалеку от Лондона, в отличие от своих коллег, был уверен, что американские сорта хмеля принадлежат к одному виду, а европейские — к другому. «Все книги твердят о том, что разновидности хмеля, культивируемые по всему миру, произошли от Humulus lupulus, – писал он в 1917 году. — Я убежден, что это не так».

В 1906 году Салмон возглавил зарождающуюся в Уайе программу разведения хмеля. Ссылаясь на принципы наследственности Грегора Менделя, он уверял, что смолы и аромат — это «устойчивые качества», присущие определенному сорту хмеля, и они не зависят от региона выращивания. Его целью было создание гибридных, трансатлантических сортов хмеля, которые имели бы ароматический профиль, который предпочитали британские пивовары, и повышенное содержание смол, присущее американскому хмелю.

Профессор садоводства Канады Уильям Тиррелл Макоун предоставил необходимый Салмону сорт северо-американского хмеля. Хмель был собран в городке Морден, расположенном к югу от Виннипега, в провинции Манитоба. Вдоль ручья, протекавшего через город, произрастал дикий хмель. «Старожилы города уверяли меня, что в районе никогда не высаживались культурные сорта хмеля», – писал Макоун. Хмель высаживали на территории города, чтобы облагородить невзрачные участки.

В 1917 году Салмон посадил в питомнике в Уайе хмель, который он обозначил как BB1. Он опылился пыльцой неизвестного сорта английского хмеля. Осенью 1918 года Салмон собрал семена, в 1919 году вырастил сотни дочерних растений BB1, а в 1922 году пересадил самые сильные экземпляры в питомник. Двум из них спустя два десятилетия испытаний в пивоварении он присвоил имена и представил их обществу.

Ни пивовары, ни фермеры Соединенного Королевства не оценили эти два первых сорта, получивших название Brewer’s Gold («Золото пивовара») и Bullion («Золотой слиток»), но основа грядущих изменений была заложена. Когда Салмон начинал работу в Уайском колледже, хмель содержал в среднем 4% альфа-кислот, максимум — 6%. С тех пор селекционеры создали сорта хмеля, шишки которых содержат более 20% альфа-кислот, и практически во всех случаях они являются потомками двух первых сортов Салмона. Относительно недавно определение того, что представляет собой приятный хмелевой вкус и аромат, расширилось, добавились фруктовые и экзотические характеристики. Популярные сорта, такие как Citra, Mosaic, Centennial и Sorachi Ace, в той или иной степени являются потомками Brewer's Gold.

В конечном счете, утверждение Салмона о том, что хмель из Америки отличается от хмеля из Англии или Европы, оказалось верным. Ученые пришли к единому мнению о том, что эти рода растений разделены более чем миллионом лет эволюции. Недавно путем химического и молекулярно-генетического анализа было установлено, что американский дикий хмель более разнообразен, чем европейский.

Сбор данных

Век назад найти дикий хмель, доказывавший правильность теории, Салмону помогла удача. Сегодня же ученые, занимающиеся исследованиями хмеля, имеют ряд инструментов, позволяющих определить, произрастало ли растение в северной части штата Нью-Йорк или на юго-западе страны, или же оно родом с другого континента, или, быть может, оно является гибридом американского дикого и европейского хмеля. Использование секвенирования нового поколения стимулирует развитие хмелеводства, а следовательно, и эволюцию самого хмеля. И актуально это не только в случае хмеля. Данная технология изменит и два других основных ингредиента пива: дрожжи и ячмень.

— Секвенирование помогает нам понять, откуда берутся различные штаммы дрожжей (или сорта хмеля и солода) и как они связаны; и, возможно, что более важно, оно помогает вывести более совершенные сорта и штаммы, сочетающие в себе лучшие качества исходных образцов, – говорит Кевин Верстрепен, генетик дрожжей из университета Лёвена и Фландрского института биотехнологии.

Технология секвенирования нового поколения зародилась в США, вытеснив старую технологию, появившуюся в 1977 году. Новая технология более быстрая, точная и, как следствие, более экономичная.

«Сегодня даже студент в одиночку, с минимальными затратами, может за секунды получить результаты, на которые раньше у ученых уходили годы», – пишут в своей книге A Natural History of Beer («Естественная история пива») Роб Десаль и Айан Таттерсолль.

Секвенирование начинается с упорядочения строительных блоков, называемых нуклеотидными основаниями (их существует четыре вида), внутри небольшого отрезка ДНК. Фрагменты сопоставляются для поиска совпадающих участков, чтобы секвенировать более крупные участки ДНК и, в конечном итоге, целые хромосомы. Геном – совокупность генов, содержащихся в ДНК организма. Метод Сэнгера, разработанный в 1970-х годах британским биохимиком Фредериком Сэнгером, позволяет секвенировать по одному фрагменту ДНК за раз. Платформы секвенирования нового поколения способны одновременно сопоставлять миллионы фрагментов.

Ученые впервые секвенировали штаммы дрожжей, используемые пивоварами и пекарями, в 1996 году, выявив свыше 12 млн химических субъединиц. Это был шаг на пути к секвенированию человеческого генома, проекту, который занял более десяти лет и обошелся в 3 млрд долларов (секвенирование первого человеческого генома само по себе стоило около 1 млрд долларов). Сегодня лаборатории за ту же работу берут от 300 до 1500 долларов. Секвенирование стало настолько дешевым, что в 2012 году биотехнологическая компания Illumina, расположенная в Сан-Диего, неподалеку от White Labs, бесплатно секвенировала 96 штаммов дрожжей, чтобы протестировать оборудование для секвенирования нового поколения.

Вскоре после этого руководитель отдела исследований и разработок в White Labs Троэльс Праль узнал, что группа бельгийских исследователей во главе с Верстрепеном также изучает фенотипический ландшафт дрожжей, то есть связывает то, что было выявлено генетически, с наблюдаемыми признаками. Совместно эти две команды секвенировали геномы 157 штаммов дрожжей, большая часть которых используется в пивоварении. Опубликованная в 2016 году книга Domestication and Divergence of Saccharomyces cerevisiae Beer Yeasts («Одомашнивание и дивергенция пивных дрожжей Saccharomyces cerevisiae») представляет собой реконструкцию истории эволюции дрожжей на протяжении веков, описывает их генеалогическое древо и предоставляет карту размножения и развития штаммов в будущем.

Геном растений зачастую длиннее человеческого, потому что в нем гораздо больше повторяющихся элементов. В период с 2000-го по 2008 год ученые секвенировали геномы лишь 10 растений. Открытие маркеров — однонуклеотидных полиморфизмов, впервые обнаруженных в геноме человека, — облегчило составление генетических карт и позволило использовать их для сопоставления с признаками. Геномы ячменя (Hordeum vulgare L.) и хмеля (Humulus lupulus) входят в число 600 собранных с тех пор геномов растений.

77 ученым из 10 стран потребовалось 10 лет, чтобы собрать воедино упорядоченную последовательность генома ячменя, которая была опубликована в 2017 году. Исследователи выявили, что ген альфа-амилазы, фермента, расщепляющего до сахаров крахмал в соложёном ячмене, повторяется несколько раз.

— Это расширяет наши знания о том, как можно увеличить содержание фермента. Имея несколько копий, мы можем выбрать те, что хотим размножить, – сказал Гэри Ханнинг, директор по глобальным исследованиям ячменя для Anheuser-Busch InBev, когда исследование было опубликовано.

Впервые о выявлении молекулярных маркеров в хмеле было заявлено в 1995 году. За последующие четыре года было обнаружено всего 224 маркера. Сегодня в тысячах сортов хмеля по всему миру обнаружено более миллиона однонуклеотидных полиморфизмов. Однако сопоставление маркеров и выявление необходимых признаков — будь то устойчивость к болезням или уникальные ароматы — может в некоторых случаях занимать много времени.

— Мы пока что не добились желаемого результата. Это новый рубеж, — поясняет Пол Мэттьюс, работающий старшим научным сотрудником в Hopsteiner, международной компании, занимающейся торговлей хмелем и имеющей селекционные программы в Соединенных Штатах и Германии. — Мы все ещё пребываем на стадии утверждения концепции.

Сокращение цикла

Сегодня селекционеры — независимо от того, специализируются ли они на выращивании хмеля, гороха или кур — задают себе тот же вопрос, что и Грегор Мендель более 150 лет назад: «Могу ли я предсказать, как тот или иной признак передастся следующему поколению?» Принципы наследования Менделя часто служат им руководством. До того, как работа Менделя получила широкое признание, считалось, что черты характера появляются у потомства в результате сочетания родительских характеристик. Мендель установил, что упомянутые Салмоном «устойчивые признаки» (теперь понимаемые как гены) могут быть доминантными или рецессивными.

Процессы перекрестного опыления сортов при образовании семян ячменя и хмеля различны, но в обоих случаях для выведения новых сортов требуется пройти долгий путь. Селекционеры должны продумывать план на десятилетия вперед.

— Нужно запастись большим ассортиментом ароматов и дождаться, когда придут со своими идеями пивовары, – говорит Антон Лутц, селекционер Немецкого исследовательского центра хмеля. — Тогда можно будет сказать: у меня есть то, что тебе нужно.

Приведенная ниже временная шкала Университета Северной Дакоты характерна для ячменя.

Первый год: производятся скрещивания и оцениваются агрономические характеристики потомства.

Второй год: отобранные образцы выращиваются и тестируются, в том числе на устойчивость к болезням и пригодность для пивоварения.

Третий-пятый годы: растения подвергаются трем этапам полевых испытаний, а затем отправляются в лабораторию для оценки качества и устойчивости к болезням. Хорошо зарекомендовавшие себя образцы на пятый год отправляются в Американскую ассоциацию пивоваренного ячменя для первого пилотного испытания.

Шестой-седьмой годы: выбранные сорта проходят полевые испытания в 10 различных локациях. Лучшие образцы на седьмой год направляются в Американскую ассоциацию пивоваренного ячменя для проведения полномасштабных испытаний.

Восьмой-десятый годы: полномасштабные испытания продолжаются с наращиванием количества полевых испытаний. После получения одобрения Американской ассоциации пивоваренного ячменя сорту присваивается название и он становится доступен для фермеров.

Профессор Кевин Смит из Университета Миннесоты объясняет, что поиск новых генетических маркеров может не только ускорить этот трудоемкий процесс, но и расширить количество возможных изменений в течение определенного периода времени. К примеру, его лаборатория могла бы использовать генетический образец, взятый после второго года, чтобы определить экстрактивность выбранного сорта.

— Не имея генетических маркеров пришлось бы ждать от четырёх до пяти лет, прежде чем сделать замеры, — объясняет он. Кроме того, исследование маркеров образца стоит 20 долларов, а комплексный анализ сорта ячменя обойдется в 200 долларов.

Выращивание хмеля не всегда идет по плану

Размножение хмеля протекает также медленно. Джон Хеннинг, генетик-исследователь Министерства сельского хозяйства США в штате Орегон, произвел в 2000 году скрещивание, которое в дальнейшем привело к появлению сорта, получившего название Triumph. Он был представлен фермерам лишь спустя два десятилетия, в 2019 году.

Министерство сельского хозяйства США рекомендует селекционерам следовать типовому графику.

Нулевой год: скрещивание.

Первый год: саженцы выращивают в теплице, отбираются самые устойчивые к мучнистой росе.

Второй-четвёртый годы: растения испытываются в полевых условиях, оценивается урожайность и производится химический анализ.

Пятый-восьмой годы: отобранные сорта выращиваются в разных локациях. Продолжается оценка, собирается исчерпывающая информация. Образцы отправляются на пивоварни для тестовых варок. Пивовары отбирают понравившиеся.

Девятый год и далее: сорта выращиваются на коммерческих фермах. Хмель тестируется на нескольких пивоварнях. Пивовары либо принимают, либо отвергают сорт.

Как и в случае с ячменем, поиск генетических маркеров требуемых признаков в хмеле может сократить процесс селекции и увеличить число растений, которые могут быть оценены. Однако, в отличие от ячменя, хмель имеет некоторые генетические особенности.

Важные исследования, финансируемые компанией Hopsteiner, пролили свет на то, почему и когда хмель может не следовать принципам Менделя. Проще говоря, хмель не всегда воспроизводится по ожидаемому алгоритму. Проводя исследования в Университете штата Флорида, Кэтрин Истерлинг, присоединившаяся к команде Мэттьюса и Hopsteiner, заметила, что во время полового размножения хромосомы, которые должны были попарно образовывать пончикообразную структуру, собирались в длинные цепочки и кольца.

— Это наблюдение свидетельствует о том, что существует сходство последовательностей, которое простирается за пределы родительских пар хромосом, – говорит она. — Хотя некоторые растения и животные демонстрируют этот тип хромосомного поведения, оно считается крайне ненормальным, из-за этого потомство может быть менее жизнеспособным или проявлять неожиданные черты. Проще говоря, это означает, что, независимо от того, какие бы желаемые характеристики они ни проявляли, некоторые сорта хмеля могут быть непригодны для размножения.

— Да, это проблема, — говорит Мэттьюс. — Некоторые генотипы более нормальны. Другие не поддаются логике. Не все разновидности одинаковы. Используя технологии, мы можем отбирать хмель, который будет более предсказуем. Это может кардинально изменить селекцию.

Все ещё игра в цифры

В случае с дрожжами селекционеры могут выводить новые штаммы в течение нескольких дней, а не лет, но здесь есть свои подводные камни. При половом размножении дрожжи придерживаются законов Менделя. Однако анализ эволюции пивных дрожжей показал, что 40% штаммов не склонны размножаться половым путем, а другие имеют резко сниженную фертильность. Чаще всего они делятся путем бесполого почкования. В лаборатории Верстрепена «оптимизировали условия так, чтобы штаммы с ослабленными половыми циклами могли размножаться»; все упирается в изменение окружающей среды.

Используя робота, лаборатория может выводить сотни новых штаммов ежедневно.

— Мы можем делать миллионы скрещиваний, но оценка лучших штаммов требует времени и усилий. Селекция дрожжей – это игра в числа. Конечно, мы очень хорошо научились подбирать правильные родительские организмы для селекции, но даже при наличии хороших исходных организмов, большое количество скрещиваний увеличивает шансы шансы выведения суперштамма, – говорит Верстрепен.

Для измерения таких свойств, как скорость сбраживания, ученые используют «микрокапли» – крошечные капли сусла, которые чуть больше дрожжевой клетки.

— В каждую каплю опускается одна дрожжевая клетка, и отслеживается скорость потребления этой клеткой сахара. Таким путем мы можем протестировать тысячи штаммов, а не сотни, как при использовании обычного лабораторного оборудования, – отмечает Верстрепен.

Незадолго до того, как были опубликованы результаты проекта секвенирования дрожжей, основатель White Labs Крис Уайт объяснил, насколько важны эти исследования.

— Не анализируя генетическую информацию, мы мыслим категориями характерными для XIX века, – сказал он домашним пивоварам в Балтиморе. Он продемонстрировал слайд с Saccharomyces cerevisiae – пивными дрожжами верхового брожения на одной стороне и Saccharomyces pastorianus – пивными дрожжами низового брожения на другой. — Я рад, что вы пришли поговорить об этом, потому что мы в некотором смысле находимся на рубеже. Это старый подход обсуждения этого вопроса. В ближайшие несколько лет появится новый.

В чем секрет хорошего вкуса

Обсуждая, почему современные коммерческие помидоры не так вкусны, как негибридные сорта, Боб Холмс, автор книги Flavor: The Science of Our Most Neglected Sense («Вкус: наука о самом малоизученном человеческом чувстве»), возлагает вину на методы селекции. «Не секрет, что на протяжении десятилетий селекционеры, работающие со многими культурами, были сосредоточены на таких характеристиках, как устойчивость к болезням, урожайность, внешний вид, одинаковый размер, а также удобство упаковки, транспортировки и переработки… Вкуса в этом уравнении нет», – пишет он.

Имея карту генома ячменя, селекционерам не придется делать упор на одной черте, жертвуя другими качествами.

— К выведению вкуса и аромата никаких усилий не прикладывали, – добавляет Скотт Хейзел, технический директор Американской ассоциации пивоваренного ячменя.

Раньше общепринятая точка зрения гласила, что солодовый вкус и аромат создаются во время соложения. Селекционеры фокусировали свое внимание на таких агрономических характеристиках, как экстрактивность и содержание белков. Согласно недавно проведенным в Университете штата Орегон экспериментам, сорт ячменя также влияет на вкус.

— Мы запустили этот проект, задавшись вопросом о том, существуют ли ячменные вкусы и ароматы способные сохраняться после соложения и варки в конечном продукте. Это революционная идея в мире пивоварения. Мы установили, что ответ на этот вопрос утвердительный, — сказал Пэт Хейс, когда были опубликованы результаты исследования.

Исследовательская группа Хейса под названием Barley World («Мир ячменя») создала помесь британского сорта Golden Promise («Золотое обещание») с выведенной в Орегонском университете разновидностью Full Pint («Полная пинта»). Пиво, сваренное с использованием оригинальных сортов и сотен их потомков, оценивалось опытными дегустаторами.

— Потомство демонстрирует все возможные комбинации особенностей исходных растений, – пояснил Хейс. — И поскольку мы проводили ДНК-генотипоскопию потомков, мы можем определить участки генома ячменя, ответственные за эти вкусы и ароматы. Мы также обнаружили, что существуют некоторые различия в зависимости от того, где выращивался ячмень, тем не менее, наследственность играла большую роль.

В регионах, где выращивается ячмень, важно создавать крафтовые солодовни и привлекать пивоваров к варке пива из местного зерна. Как бы то ни было, открытие молекулярных маркеров сделало «вкус» одной из ключевых тем для обсуждения, что в свою очередь должно повлиять на селекционирование в будущем.

— Мы только начали задумываться о том, как мы можем управлять вкусом, – добавляет Кевин Смит из Университета Миннесоты. — Есть ли какие-то особенности, которые могут анализироваться методом количественного определения?

Секвенирование нового поколения облегчает такое изменение, а также помогает прогнозировать будущее культур, которые используются для производства пива. Селекционеры уже используют маркеры для оценки устойчивости к болезням. Если они смогут найти подобные маркеры, связанные с урожайностью, они могут создать сорта ячменя и хмеля, которые будут более экологически устойчивыми.

Четыре года назад Hopsteiner начал организовывать экспедиции на Юго-Запад США, а также в Грузию и Казахстан, для сбора дикого хмеля. Селекционеры всего мира работают над сохранением генетического разнообразия, которое могло бы помочь культурам пережить изменение климата. Ученые из Hopsteiner нашли на Юго-Западе США сорта, которые более устойчивы к засухе. Как оказалось, у такого хмеля тоже могут быть свои уникальные вкусы. Секвенирование должно помочь селекционерам идентифицировать маркеры ряда признаков.

Масло хмеля содержит до тысячи соединений, влияющих на вкус и аромат. Некоторые из них, такие как линалоол и гераниол, присутствуют в нескольких популярных сортах хмеля Нового Света. Hopsteiner уже выявила маркеры некоторых из этих соединений. Это может ускорить процесс селекционирования на два-три года, поясняет Мэттьюс.

— Вы увидите это в ближайшем будущем. Я вам это гарантирую. Не могу лишь сказать, когда точно это случится.

Несмотря на эти достижения, не все селекционеры ключевых ингредиентов пива модернизировали свой подход — по крайней мере, пока. Многие до сих пор следуют тем же принципам скрещивания, как и Салмон более 100 лет назад.

—Абсолютно тем же, – добавляет Питер Дарби, который возглавил селекционную программу в Уайском колледже в 1981 году. — Всё творчество ограничивается выбором исходных образцов для скрещивания.